Universidade estadual de maringá



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Palavras-chaves: Paracoccidioidomicose. Tuberculose. Western blott. Diagnóstico diferencial.

ABSTRACT

A preliminary study was performed with the aim to standardize a Western blot technique for differential diagnosis between paracoccidioidomycosis and tuberculosis. This study proposed a cut-off to minimize cross reaction between both diseases showing a potential tool to be included in clinical laboratories.


Key-words: Paracoccidioidomycosis. Tuberculosis. Western Blot. Differentiate diagnosis.
Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica, de natureza granulomatosa, causada pelo fungo termo-dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. É a oitava causa de morte no Brasil considerando as doenças infecciosas e parasitárias predominantemente crônicas, superando inclusive a leishmaniose, demonstrando que essa doença possui grande magnitude e pequena visibilidade5. Trata-se de uma doença grave que se apresenta com uma variada gama de sinais e sintomas clínicos classificados em duas formas: aguda ou subaguda “tipo juvenil”, por acometer principalmente crianças ou adolescentes, e a forma crônica “tipo adulto”. A primeira é a forma mais rara, porém mais grave, atinge gânglios linfáticos, baço, fígado, levando com freqüência à disfunção da medula óssea. A maioria dos casos entretanto, evolui para a forma crônica, caracterizada por comprometimento pulmonar, lesões ulceradas de pele, mucosas (oral, nasal, gastrointestinal), baço e fígado e por linfadenopatia13.

O polimorfismo da apresentação clínica da PCM permite que esta doença seja incluída no diagnóstico diferencial de vários agravos humanos, de origem infecciosa ou não. Entre as doenças respiratórias, a diferenciação deve ser feita com a histoplasmose, coccidioidomicose, sarcoidose e principalmente com a tuberculose (TB)1 10.

A associação entre PCM e TB não é incomum, ocorre numa freqüência que varia entre 5,5 a 15,8%9 11 e, a determinação do diagnóstico diferencial entre elas, baseada unicamente em dados clínicos e radiológicos, pode ser difícil. As duas doenças podem ocorrer de forma simultânea ou seqüencial. Em aproximadamente 75% dos casos de PCM os pulmões são comprometidos, e as lesões pulmonares iniciais teriam características semelhantes ao complexo primário da tuberculose7. Segundo Quagliato et al. (2007), o erro diagnóstico pode ocorrer, especialmente em unidades básicas de saúde, em casos cuja apresentação clínica e radiológica não permite distinção clara entre as duas doenças. O tratamento incorreto aumenta a chance de seqüelas pulmonares, tais como fibrose, bronquiectasias e insuficiência respiratória crônica.

O diagnóstico definitivo da PCM é estabelecido pela visualização de células leveduriformes de P. brasiliensis em exame micológico direto a fresco ou em técnicas histopatológicas, alternativamente pode ser fornecido pelo isolamento e identificação do fungo em cultura. Da mesma forma o diagnóstico da TB é estabelecido pela pesquisa direta dos bacilos-álcool-ácido resistentes (BAAR) e pelo isolamento e identificação do Mycobacterium tuberculosis. Essas técnicas, entretanto têm alguns importantes fatores limitantes que são inerentes aos próprios fundamentos de cada uma como o longo tempo para desenvolvimento e identificação dos agentes, baixa sensibilidade das técnicas diretas (baciloscopia e exame micológico direto). Além disso, o difícil acesso a amostras mais representativas implica que o escarro seja o material biológico de rotina para pesquisa de BAAR e P. brasiliensis. O escarro espontâneo ou induzido além de ser altamente contaminado pode não conter microrganismos suficientes para o diagnóstico direto o que aliado à possibilidade dos indivíduos já terem recebido tratamento prévio, dificulta ainda mais o desenvolvimento dos agentes e confere ao diagnóstico microbiológico menor poder discriminatório.

Portanto, a busca de métodos diagnósticos indiretos que forneçam resultados mais rápidos e seguros é objetivo de muitos grupos de estudos. A sorologia para esta micose é de extrema importância, além de auxiliar no diagnóstico, é útil no controle de cura dos pacientes13. Testes sorológicos fornecem resultados precoces aos da cultura e histopalogia e poderiam ser bem utilizados para o diagnóstico da PCM2. Contudo ainda carecem de validação para uso rotineiro em laboratórios clínicos. O teste de Imunodifusão Radial Dupla (ID) é o método sorológico clássico o qual está padronizado e é aceito, sobretudo para monitorização da terapêutica da PCM, por meio do acompanhamento da queda de anticorpos. Porém para o diagnóstico de PCM tem contribuição limitada, é questionado pela sua baixa sensibilidade, um resultado negativo não excluiria a possibilidade da doença. Por outro lado testes mais sensíveis como os imunoenzimáticos (ELISA) e Western blot (WB) poderiam contribuir com um diagnóstico mais rápido além de servirem como bons indicadores da evolução do tratamento, por detectarem concentrações menores de anticorpos que a ID.

Neste sentido o presente trabalho objetiva apresentar e discutir resultados preliminares dos testes sorológicos: ID, ELISA e WB, aplicados a uma população triada para diagnóstico de TB, na intenção de contribuir com a padronização de métodos imunológicos mais seguros, rápidos e que possam ser úteis no diagnóstico diferencial entre TB e PCM.

Com a criação do “Centro Interdisciplinar para o Diagnóstico e Acompanhamento da Paracoccidioidomicose”, pacientes sintomáticos respiratórios, triados e encaminhados para pesquisa de TB foram simultaneamente investigados quanto à PCM. Realizaram-se exames de baciloscopia e cultura para BAAR, exame micológico direto a fresco (MD), ID3 e ELISA8. A técnica de WB14 somente foi empregada nas situações em que o diagnóstico para TB e/ou PCM eram positivos.

A técnica de ELISA utilizada neste estudo baseou-se em Maluf et al. (2003). O ponto de corte utilizado foi densidade óptica (DO)=1,0. Para padronização do método WB soro de cinco pacientes com PCM confirmada foram diluídos até 1:800. Destes um tinha resultado negativo à ID e quatro com ID positiva com títulos de 1:2, 1:4, 1:16 e 1:32. Ainda nesta bateria de padronização foi utilizado soro de um paciente com TB e sem PCM (excluída por critérios clínicos e laboratoriais). Os resultados de WB foram positivo até a diluição de 1:800 para os soros dos cinco pacientes com PCM. Já para o paciente com TB a reação de WB foi positiva até a diluição de 1:200, ou seja, até esta diluição há possibilidade de reações cruzadas entre PCM e TB. Diante deste panorama fixou-se como ponto de corte a diluição 1:400 para a técnica de WB13, título este que incluiu pacientes com baixos níveis de anticorpos em ID e excluiu resultados falso-positivos ou possível reação cruzada com TB.

No período de estudo compreendido entre Fevereiro de 2007 e Agosto de 2008 foram analisadas amostras de escarro de 540 pacientes. Destes somente foi possível obter amostras de sangue de 250 pacientes. Até o momento foi possível realizar todos os exames (BAAR, cultura para BK, MD, ID, ELISA e WB), de 134 deles dos quais 11 (8,2%) foram confirmados com TB pulmonar e seis (4,5%) tiveram diagnóstico micológico (MD) positivo para PCM. Este dado é relevante visto que a população havia sido triada para pesquisa de TB, não havia nenhuma suspeita de PCM, comprovando que essa micose está sendo subvalorizada. Não houve concomitância das duas doenças, todas as amostras dos indivíduos TB positivos foram negativas para a pesquisa do fungo.

O perfil sorológico dos seis pacientes com PCM foi: somente um (16,7%) teve resultado positivo para ID, confirmando a baixa sensibilidade do método. Já em quatro deles (66,67%) foi encontrada DO superior a 1,0 ao teste de ELISA, enquanto todos os pacientes com PCM apresentaram resultado positivo para WB na diluição 1:400.

A especificidade dos testes sorológicos depende da qualidade do antígeno de P. brasiliensis utilizado e do grau de reações cruzadas com outras enfermidades originando resultados falso positivos4. A fim de eliminar estes interferentes e padronizar uma técnica de ELISA e WB reprodutível, utilizou-se para este estudo o antígeno de P. brasiliensis produzido pelo Centro de Produção e Pesquisa de Imunobiológicos (CPPI) e distribuído aos laboratórios públicos. Este é o antígeno utilizado para realização da ID há quase 10 anos3.

Nossos resultados preliminares permitem algumas conclusões importantes para a abordagem diagnóstica dessas duas doenças: ID realmente não tem valor diagnóstico, pois apenas detectaria um dos seis indivíduos positivos para PCM. ELISA foi mais sensível que ID, mas ainda carece de ajustes na padronização, pois com esse valor de corte teria detectado apenas quatro dos seis doentes de PCM, colocando em risco inclusive a sugestão de uso dessa técnica como ferramenta epidemiológica em inquéritos sorológicos6 8. Também não poderia servir de critério para diagnóstico definitivo de PCM tendo em vista uma reação falso-positiva em paciente de TB.



A maior contribuição deste estudo preliminar é, portanto, mostrar que a técnica de WB pode ser utilizada como ferramenta para firmar o diagnóstico diferencial entre TB e PCM, encaminhando para tratamento seguro pelo menos seis pacientes, triados e encaminhados para pesquisa de BAAR e, excluiu a concomitância das duas doenças. Sem esta investigação sorológica, provavelmente estes pacientes não seriam diagnosticados corretamente, ou ainda, poderiam ter sido diagnosticados com TB devido a alterações radiológicas e indicação clínica de tratamento empírico anti-TB, podendo evoluir para óbito devido a PCM.



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