Seminário em Microscopia Eletrônica de Transmissão Professora Dra. Sônia Nair Báo Pedro Henrique Miranda Bürgel Raffael Júnio Araújo de Castro Contrastação Negativa História e aplicações - Surgimento – Análise de vírus
- Arranjo de subunidades, caracterização de membrana, caracterização de produtos de degradação parcial, interação com anticorpos
- Rapidamente difundido na microscopia eletrônica (1960-1980)
- Simetria de proteínas oligoméricas, estudos de complexos enzimáticos, componentes musculares, ribossomos, etc...
Resolução e integridade - Amostras muito pequenas
- Resolução com contrastação positiva é ineficaz para alta resolução (camada de resina)
- Dificuldades de processamento
Diferenças Alta resolução e ampliação - Recomenda-se o uso de lente condensadora dupla e “anticontaminador”
Contrastantes - Contrastantes negativos (sais de metal pesado)
- Urânio, Tungstênio ou Molibdênio
- Soluções aquosas com 1-2%
- Acetato de Uranila
- Uso: Vírus, bactérias, frações celulares, macromoléculas (DNA, actina, enzimas)
- Contrastação positiva: afinidade por lipoproteínas
- Fotossensível
- Incompatível com tampão fosfato e compatível com os tampões CACO e tris
- Dupla toxicidade
Contrastantes - Ácido fosfotúngstico (PTA)
- Uso: Vírus, bactéria, frações celulares, macromoléculas (DNA, actina, enzimas)
- pH mais neutro: bom para partículas instáveis em pH ácido
- Aditivos como SFB e albumina sérica bovina para aumentar hidrofilicidade
- Compatível com tampões fosfato
Contrastantes - Molibdato de amônia
- Uso: membranas, subunidades de enzimas, frações celulares
- Melhor resolução com detalhes extremamente finos
- Contraste: acetato de uranila > MA ≈ PTA
Prática - Grid revestido (Formvar ou Colódio e/ou Carbono)
- Maior estabilidade
Procedimentos
Amostra diluída
Gota flutuação
- Permite lavagens
Spray
- Melhor adsorção
- Melhor distribuição
- Forma aerossóis tóxicos
e/ou contaminantes
- Gasta mais amostra
Vesículas de Vibrio cholera
Vesículas de C. neoformans
DEM – Microscopia Eletrônica diagnóstica Diagnóstico rápido Descoberta de patógenos
Vírus injetado
Vírus recuperado do trato respiratório
Appendix. Directory of electron microscope facilities which may provide assistance and advice concerning emergency viral diagnostic matters.
Sri Lanka Mohamed Abdul Azeez Razak Colombo, Sri Lanka
Phone: 94 1-693532, 1-693533, 1-693534, ext. 411 Fax: 94 1-575405
e-mail: azeezrazak@hotmail.com, medresit@slt.lk
France Pierre Gounon Nice, France
Phone: 33 04 92 07 60 46 Fax: 33 04 92 07 60 45 e-mail: gounon@unice.fr
Brazil Hermann Schatzmayr Rio de Janeiro, Brazil
Phone: 55 21 598 4274 Fax: 55 21 270 6397
e-mail: Hermann@ioc.fiocruz.br
Marli Ueda São Paulo, Brazil
Phone: 55 11-3068-2908 Fax: 55 11-3088-3753
e-mail: marliueda@hotmail.com
bioterrorismo
poxvirus
herpesvirus
Referências - Electron Microscopy: Methods and Protocols. 3.Ed, John Kuo, Cap. 11, 2014
- Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications. Vol. 2, M. A. HAYAT, Cap. 3, 1972
- Electron microscopy principles and techniques for biologists. 2ª ed. Bozzola, J. J. & Russel, L. D.Boston, Ed. Jones & Bartlett, 1992.
- Técnicas de microscopia eletrônica aplicadas às ciências biológicas. 3.Ed, Wanderlley de Souza, Cap 9, 2007
- Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. M. Gentile, H.R. Gelderblom, New Microbiologica, 37, 403-422, 2014
- Newly discovered coronavirus as the primary cause of severe acute respiratory syndrome. Kuijen et. al. THE LANCET • Published online July 22, 2003.
- Electron Microscopy for Rapid Diagnosis of Infectious Agents in Emergent Situations. Paul R. Hazelton, Hans R. Gelderblom, Emerging Infectious Diseases • Vol. 9, No. 3, March 2003
- Bioterrorism and Electron Microscopic Differentiation of Poxviruses from Herpesviruses: Dos and Don’ts. S. E. Miller, Ultrastructural Pathology, 27:133–140, 2003
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