Contrastação Negativa



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Contrastação Negativa

Seminário em Microscopia Eletrônica de Transmissão

Professora Dra. Sônia Nair Báo

Pedro Henrique Miranda Bürgel

Raffael Júnio Araújo de Castro

Contrastação Negativa

História e aplicações

  • Surgimento – Análise de vírus
    • Arranjo de subunidades, caracterização de membrana, caracterização de produtos de degradação parcial, interação com anticorpos
  • Rapidamente difundido na microscopia eletrônica (1960-1980)
    • Simetria de proteínas oligoméricas, estudos de complexos enzimáticos, componentes musculares, ribossomos, etc...

Resolução e integridade

  • Amostras muito pequenas
    • Resolução com contrastação positiva é ineficaz para alta resolução (camada de resina)
  • Dificuldades de processamento

Diferenças

Alta resolução e ampliação

    • Recomenda-se o uso de lente condensadora dupla e “anticontaminador

Contrastantes

  • Contrastantes negativos (sais de metal pesado)
    • Urânio, Tungstênio ou Molibdênio
    • Soluções aquosas com 1-2%
  • Acetato de Uranila
    • Uso: Vírus, bactérias, frações celulares, macromoléculas (DNA, actina, enzimas)
    • Contrastação positiva: afinidade por lipoproteínas
    • Fotossensível
    • Incompatível com tampão fosfato e compatível com os tampões CACO e tris
    • Dupla toxicidade

Contrastantes

  • Ácido fosfotúngstico (PTA)
    • Uso: Vírus, bactéria, frações celulares, macromoléculas (DNA, actina, enzimas)
    • pH mais neutro: bom para partículas instáveis em pH ácido
    • Aditivos como SFB e albumina sérica bovina para aumentar hidrofilicidade
    • Compatível com tampões fosfato

Contrastantes

  • Molibdato de amônia
    • Uso: membranas, subunidades de enzimas, frações celulares
    • Melhor resolução com detalhes extremamente finos
    • Contraste: acetato de uranila > MA ≈ PTA

Prática

  • Grid revestido (Formvar ou Colódio e/ou Carbono)

- Maior estabilidade

Procedimentos


Amostra diluída

Gota

flutuação


- Permite lavagens

Spray


- Melhor adsorção

- Melhor distribuição

- Forma aerossóis tóxicos

e/ou contaminantes

- Gasta mais amostra

Aplicações biológicas

  • Acompanhamento e confirmação do isolamento e purificação de organelas, proteínas, vesículas.

Isolamento de vesículas extracelulares


Vesículas de Vibrio cholera

Vesículas de C. neoformans


DEM – Microscopia Eletrônica diagnóstica

Diagnóstico rápido

Descoberta de patógenos


Vírus injetado

Vírus recuperado do trato respiratório

Appendix. Directory of electron microscope facilities which may provide assistance and advice concerning emergency viral diagnostic matters.

Sri Lanka Mohamed Abdul Azeez Razak Colombo, Sri Lanka

Phone: 94 1-693532, 1-693533, 1-693534, ext. 411 Fax: 94 1-575405

e-mail: azeezrazak@hotmail.com, medresit@slt.lk

France Pierre Gounon Nice, France

Phone: 33 04 92 07 60 46 Fax: 33 04 92 07 60 45 e-mail: gounon@unice.fr



Brazil Hermann Schatzmayr Rio de Janeiro, Brazil

Phone: 55 21 598 4274 Fax: 55 21 270 6397

e-mail: Hermann@ioc.fiocruz.br

Marli Ueda São Paulo, Brazil

Phone: 55 11-3068-2908 Fax: 55 11-3088-3753

e-mail: marliueda@hotmail.com


bioterrorismo


poxvirus

herpesvirus

Referências

  • Electron Microscopy: Methods and Protocols. 3.Ed, John Kuo, Cap. 11, 2014
  • Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications. Vol. 2, M. A. HAYAT, Cap. 3, 1972
  • Electron microscopy principles and techniques for biologists. 2ª ed. Bozzola, J. J. & Russel, L. D.Boston, Ed. Jones & Bartlett, 1992.
  • Técnicas de microscopia eletrônica aplicadas às ciências biológicas. 3.Ed, Wanderlley de Souza, Cap 9, 2007
  • Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. M. Gentile, H.R. Gelderblom, New Microbiologica, 37, 403-422, 2014
  • Newly discovered coronavirus as the primary cause of severe acute respiratory syndrome. Kuijen et. al. THE LANCET • Published online July 22, 2003.
  • Electron Microscopy for Rapid Diagnosis of Infectious Agents in Emergent Situations. Paul R. Hazelton, Hans R. Gelderblom, Emerging Infectious Diseases • Vol. 9, No. 3, March 2003
  • Bioterrorism and Electron Microscopic Differentiation of Poxviruses from Herpesviruses: Dos and Don’ts. S. E. Miller, Ultrastructural Pathology, 27:133–140, 2003



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