Companhia Ambiental do Estado de São Paulo


 Preparação da amostra para a filtração



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L5403
6.3.5 Preparação da amostra para a filtração:

Aquecer as amostras em banho-maria a 60 

±

 0,5ºC durante 15 minutos, para eliminação de



organismos não esporulados e formas vegetativas, esfriando-as imediatamente após em água fria.

6.3.5.1 Para volumes iguais ou superiores a 20mL:

a)  Homogeneizar a amostra , no mínimo 25 vezes, inclinando o frasco, formando um ângulo de

cerca de 45

°

 entre o braço e o antebraço.



b)  Distribuir os volumes requeridos da amostra em provetas estéreis e proceder à filtração como no

item 6.3.6 .

6.3.5.2 Para volumes inferiores a 20mL:

a)  Homogeneizar a amostra conforme descrito no item  6.3.5.1 a e, com o auxílio de uma pipeta

estéril, retirar o volume desejado e adicionar a um frasco contendo 90mL de água de diluição

estéril. Este  volume servirá apenas de suporte para que as bactérias que possam estar presentes na

amostra se distribuam uniformemente na superfície da membrana, ao ser efetuada a filtração; e

b)  Homogeneizar  e proceder à filtração como no item 6.3.6.



6.3.5.3 Para volumes decimais (diluições da amostra):

a)  Efetuar as diluições decimais da amostra da seguinte forma:

-  Proceder a marcação de cada frasco de água de diluição estéril, anotando o número da amostra e

a diluição que deverá conter;

-  Homogeneizar a amostra como no item  6.3.5.1.a e, com uma pipeta estéril de 10mL,

obedecendo aos cuidados de assepsia, transferir 10mL da amostra para um frasco previamente

identificado, contendo 90 

±

 2mL de água de diluição estéril. Estará preparada assim a primeira



diluição decimal (10 

–1 


), sendo que 1mL da mesma corresponde ao volume de 0,1mL da amostra;

-  Repetir a operação segundo o item anterior, com o frasco contendo a diluição feita

anteriormente (10 

–1

) e desta, com uma nova pipeta estéril de 10mL, transferir 10mL para um novo



frasco, previamente identificado, contendo 90 

±

 2mL de água de diluição estéril. Prepara-se assim a



segunda diluição decimal (10

-2

), sendo que 1mL da mesma corresponde ao volume de 0,01mL da



amostra;

-  Proceder dessa maneira na seqüência das diluições desejadas (10

-3

, 10


-4

, ...10


-8

,...); e


b)  Após o preparo das diluições e homogeneização da diluição selecionada para a filtração

conforme item 6.3.5.1.a retirar o volume desejado com uma pipeta estéril e  adicionar a um frasco

contendo 90mL de água de diluição estéril  (este volume servirá apenas de suporte para que as



CETESB /L5.403 / junho/2004

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bactérias que possam estar presentes na amostra,  distribuam-se uniformemente na superfície da



membrana, ao ser efetuada a filtração). Homogeneizar e proceder a filtração como no item 6.3.6.


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