Companhia Ambiental do Estado de São Paulo



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6.  Execução do Ensaio

6.1. Princípio do método

A técnica de membrana filtrante para quantificação de Clostridium perfringens baseia-se na

filtração de volumes adequados de água, mediante pressão negativa (vácuo), através de membrana

filtrante, com porosidade de 0,45

µ

m . Essas bactérias, apresentando dimensões maiores que o poro



da membrana, ficarão retidas em sua superfície, a qual será então transferida para uma placa de

Petri, contendo o meio de cultura seletivo e diferencial Ágar mCP. Por capilaridade, o meio se

difundirá para a membrana, entrando em contato com as bactérias; após um período de 24 h de

incubação a 44,5 

±

 0,2


°

C em anaerobiose, se desenvolverão colônias com características típicas

(coloração amarelo palha). A sacarose e o indoxil  

β

-D glucosídeo presentes no Ágar mCP são os



componentes que permitem a diferenciação dessa bactéria. A fermentação da sacarose é

evidenciada pela coloração amarelo palha das colônias, devido à viragem do indicador de pH

(púrpura de bromocresol) e a hidrólise do indoxil  

β

- D glucosídeo, pela coloração azul das mesmas.



Como  Clostridium perfringens fermenta a sacarose, mas não fermenta a celobiose (glicose 

β

-D



glucosídeo) não hidrolisando o indoxil  

β

-D glucosídeo, suas colônias apresentam-se com coloração



amarela nesse meio. Após o período de incubação, a membrana contendo as colônias típicas em sua

superfície, é submetida ao teste para fosfatase ácida através da exposição a vapores do hidróxido de

amônio durante 10-30 segundos. O Ágar mCP contém o difosfato de fenolftaleína em sua

composição e, como Clostridium perfringens é capaz de produzir a enzima fosfatase ácida, que

determina a hidrólise dessa substância, com liberação de fenolftaleína, as colônias típicas desta

bactéria irão apresentar uma coloração rosa escuro ou magenta, após exposição a vapores de

hidróxido de amônio. A partir da contagem destas colônias, calcula-se a densidade de Clostridium

perfringens na amostra analisada.

6.2 Amostragem

Deve ser efetuada segundo as especificações apresentadas no Guia de Coleta e Preservação de

Amostras de Água  (CETESB; 1988).



CETESB /L5.403 / junho/2004

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